| 靈芝對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子（TNF）的影響 |
| 【 整理發(fā)布：王力野生靈芝網(wǎng) 】 【 發(fā)布日期：7/6/2011 】 瀏覽次數(shù):2525 |
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提要 靈芝1～100μg/ml對L92細(xì)胞的生長無直接影響。在加靈芝與不加靈芝的條件下觀察重組腫瘤壞死因子（γTNF）對L929細(xì)胞的殺傷作用證明靈芝不影響γTNF的殺傷腫瘤細(xì)胞活性。但靈芝0.01～100μg/ml在試管內(nèi)促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF。巨噬細(xì)胞在試管內(nèi)經(jīng)靈芝預(yù)培養(yǎng)8h后，洗去藥物再加LPS，發(fā)現(xiàn)靈芝對細(xì)胞的預(yù)處理可以增加巨噬細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)下TNF的產(chǎn)生。此外，整體研究證明口服靈芝100～300mg/kg qd×14可以增高由BCG啟動及內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠血清中TNF水平。
靈芝 腫瘤壞死因子
1975年Carswell等報道接種卡介苗(BCG)后又注射內(nèi)毒素的小鼠血清可使多種小鼠腫瘤因出血壞死而消退,但并不影響正常細(xì)胞[1].現(xiàn)在知道此乃由腫瘤壞死因子(TNF)介導(dǎo),并證明TNF是由單核細(xì)胞系產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì),能導(dǎo)致多種動物腫瘤出血與壞死,并在試管內(nèi)對培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞具有直接殺傷作用。近年利用遺傳工程制備了重組的TNF，對TNF的研究愈益深入，證明其有廣泛的生物學(xué)活性，對纖維母細(xì)胞有致分裂作用，能激活粒細(xì)胞功能，刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并能調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能。這些結(jié)果說明TNF是一種能介導(dǎo)機(jī)體多種免疫與炎癥過程的重要細(xì)胞因子[2～3]。
靈芝（Ling Zhi, LZ, Ganoderma Lucidum, Fr. Karst）長期用作保健藥品。上海醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室在前階段工作中已報道靈芝能調(diào)節(jié)多種免疫功能。包括刺激巨噬細(xì)胞吞噬，提高網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能，促進(jìn)碳粒廓清，增加Lps誘導(dǎo)的IL-1產(chǎn)生，以及抑制抗體形成細(xì)胞及遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)等。為進(jìn)一步了解靈芝的免疫藥理作用，本文重點(diǎn)研究靈芝對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF的影響。
材料與方法
動物
C57BL/6小鼠，♂，8～10周齡；昆明種小鼠，♂，20～24g。均由上海醫(yī)科大學(xué)實驗動物部供應(yīng)。
細(xì)胞株
小鼠纖維母細(xì)胞瘤L929細(xì)胞株由上海第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院錢定華教授惠贈，于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
試劑
靈芝由日本和漢生藥研究所制備熱水提取物，按前文方法配制。脂多糖（Lps）為Sigma產(chǎn)品。γTNF由錢定華教授惠贈�？ń槊缂傲蛞掖妓徕c培養(yǎng)基由衛(wèi)生部上海生物制品研究所供應(yīng)。內(nèi)毒素由第二軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室制備。結(jié)晶紫為上海崇明試劑廠產(chǎn)品。RPMI-1640為GIBCO產(chǎn)品，按前文方法配制。
在試管內(nèi)誘導(dǎo)TNF產(chǎn)生
小鼠腹腔注射5%硫乙醇酸鈉2ml后4d取腹腔細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2.5×106/ml，加入24孔培養(yǎng)板，每孔1ml。37℃ 5% CO2中培養(yǎng)2h，洗去上浮細(xì)胞。各孔加或不加脂多糖和不同濃度靈芝，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收獲不含細(xì)胞含TNF的上清液，置-30℃，待測。
整體TNF之產(chǎn)生
昆明種小鼠靜脈注射BCG 0.02% 0.2ml，隨機(jī)分成4組：對照組口服0.5% CMC 0.5ml qd.×14；其余三組分別口服靈芝100，200，300mg/kg qd.×14。兩周后每鼠靜脈注射25μg內(nèi)毒素，90min后眼眶靜脈竇取血，分離血清，置-30℃，臨用前適當(dāng)稀釋。
TNF測定
因為L929細(xì)胞對于TNF的殺傷作用很敏感，為此TNF活力的測定采用結(jié)晶紫染色經(jīng)TNF處理的L929表示[4]。以每ml含5×105個細(xì)胞（活力>95%）接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔100μl，37℃ 5% CO2中培養(yǎng)20h。每個實驗條件復(fù)孔3只。培養(yǎng)終止后取出培養(yǎng)板快速傾出培養(yǎng)液，加入100μl經(jīng)適當(dāng)稀釋的待測樣品及100μl含放線菌素-D的RPMI-1640，使最終濃度為1μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)20h，移去上清，培養(yǎng)板于0.5%結(jié)晶紫中染色20min，淋洗，板自然干燥，以酶標(biāo)儀于590nm處測OD值。
細(xì)胞毒%（Oytotoxicity %）計算公式如下
ODtest
ODtest
細(xì)胞毒%= ×100%
ODcon
OD為未被殺傷L929細(xì)胞結(jié)晶紫染色后于590nm的吸收度，OD值越大，細(xì)胞殺傷越小。
ODcon——對照孔，即無TNF孔的OD值
ODtest——加入各種稀釋度TNF樣品的OD值
TNF單位U/ml——樣品殺傷50%靶細(xì)胞時的稀釋倍數(shù)
結(jié) 果
靈芝對L929細(xì)胞生長的影響
如表8-1所示，在試管內(nèi)，靈芝1～100μg/ml對L929細(xì)胞的生長無直接影響。
表8-1 靈芝對L929活性影響
藥物 劑量μg/ml OD
對照 -- 0.380±0.02
靈芝 1 0.357±0.015
靈芝 10 0.370±0.036
靈芝 100 0.363±0.021
二、 靈芝對γTNF殺傷腫瘤細(xì)胞作用的影響
表8-2證明5U γTNF可產(chǎn)生76.3%的細(xì)胞毒作用，加入靈芝1～100μg/ml并不影響5U γTNF的作用。
表8-2 靈芝對γTNF作用的影響
藥物 μg/ml γ-TNF（U） 細(xì)胞毒%
對照 -- 5 76.3±1.3
靈芝 1 5 75.6±0
靈芝 10 5 74.8±3.4
靈芝 100 5 77.0±5.6
三、靈芝在試管內(nèi)刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF
表8-3、8-4表明，靈芝0.02～1μg/ml在試管內(nèi)刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF，其效應(yīng)與靈芝濃度呈正相關(guān)，但高濃度靈芝100μg/ml時則轉(zhuǎn)向抑制。這說明靈芝對TNF的產(chǎn)生亦呈雙向反應(yīng)，低濃度刺激，高濃度產(chǎn)生抑制效應(yīng)。并證明未經(jīng)抽濾的靈芝在試管內(nèi)的作用較經(jīng)抽濾的靈芝為強(qiáng)。
表8-3 靈芝（未抽濾）對TNF產(chǎn)生的影響
OD TNF產(chǎn)量
組別 μg/ml 上清稀釋 （U/ml）
1∶40 1∶80 1∶160
對照 -- 0.137±0.015 0.210±0.01 0.260±0.01 63.4±2.1
靈芝 0.01 0.150±0 0.170±0.01* 0.210±0.017* 89.9±6.1**
靈芝 0.1 0.133±0.006 0.177±0.006* 0.220±0.01* 86.7±4.0**
靈芝 1 0.120±0 0.180±0.02 0.200±0.026* 103.8±5.3**
靈芝 10 0.143±0.025 0.173±0.015 0.207±0.012** 93.9±6.0**
靈芝 100 0.147±0.006 0.207±0.015 0.247±0.015 61.8±2.5
對照孔OD值：0.363±0.006; X±SD; n=3; 與對照組比*P<0.05, **P<0.01
表8-4 靈芝（抽濾）對TNF產(chǎn)生的影響
OD TNF產(chǎn)量
組別 μg/mg 上清稀釋 （U/ml）
1∶40 1∶80 1∶160 1∶320
對照 -- 0.347±0.025 0.420±0.053 0.473±0.015 0.493±0.07 64.8±6.8
靈芝 0.01 0.330±0.017 0.473±0.047 0.540±0.062 0.623±0.03 55.2±3.1
靈芝 0.1 0.323±0.015 0.463±0.02 0.502±0.02 0.590±0.053 60.3±3.8
靈芝 1 0.263±0.012* 0.420±0.035 0.493±0.025 0.603±0.05 81.7±3.9*
靈芝 10 0.283±0.024* 0.390±0.035 0.517±0.04 0.610±0.06 79.4±3.8*
靈芝 100 0.350±0.01 0.507±0.04 0.650±0.017 48.4±1.7*
對照孔OD值：0.787±0.015; X±SD; n=3; 與對照組比較：*P<0.05
四、靈芝預(yù)處理巨噬細(xì)胞對后者誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF的作用
觀察巨噬細(xì)胞經(jīng)靈芝預(yù)培養(yǎng)后誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF的情況。巨噬細(xì)胞（2.5×106/ml）與含靈芝0.01～100μg/ml或不含靈芝對照組培養(yǎng)8h后，傾去上清，細(xì)胞洗2次，加入Lps 10μg/ml，37℃ 5% CO2中培養(yǎng)24h。測定上清TNF活力。結(jié)果表明靈芝預(yù)處理可使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF略有增加（表8-5）。
表8-5 靈芝預(yù)培養(yǎng)對TNF釋放的影響
組別 劑量 μg/ml TNF細(xì)胞毒 %
對照 -- 45.6±2.5
靈芝 0.01 57.5±5.9*
靈芝 0.1 47.8±2.5
靈芝 1 57.2±2.5**
靈芝 10 53.9±1.9*
靈芝 100 51.1±3.8*
五、整體研究靈芝對TNF產(chǎn)生的影響
表8-6表明口服靈芝100，200，300mg/kg qd.×14可使BCG啟動內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠血清TNF水平明顯上升。
表8-6 靈芝在整體對TNF產(chǎn)生的影響
組別 劑量 mg/kg TNF 細(xì)胞毒 %
對照 -- 2.90±1.2
靈芝 100 50.0±7.5**
靈芝 200 40.0±9.9**
靈芝 300 26.5±8.9*
討 論
自TNF受到廣泛注意以來，有些學(xué)者建立了多種簡單而又敏感的試管內(nèi)測定TNF活性的方法，如3H-TdR釋放法，中性紅染色法及結(jié)晶紫染色法等。Flick等曾比較上述方法[4]，認(rèn)為以放線菌素-D處理靶細(xì)胞L929，再以結(jié)晶紫染色活細(xì)胞的方法最敏感。本室建立此方法且探索了L929細(xì)胞最佳密度，放線菌素-D的合適濃度及啟動用硫乙醇酸鈉的劑量等。研究證明所用方法比較敏感且可重復(fù)，加入放線菌素-D使測定更敏感，培養(yǎng)時間縮短。
本研究證明靈芝在試管內(nèi)可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF。靈芝本身對靶細(xì)胞L929并無直接殺傷作用。同時證明靈芝在試管內(nèi)與γTNF無明顯協(xié)同作用。試管內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)未經(jīng)抽濾的靈芝溶液其作用較經(jīng)抽濾的靈芝為強(qiáng)。同時證明靈芝0.01～1μg/ml促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF，在高濃度100μg/ml時則轉(zhuǎn)為抑制，這與作者通過以往研究認(rèn)為靈芝是一個免疫調(diào)節(jié)劑的觀點(diǎn)一致。
整體研究亦證明口服靈芝100～300mg/kg qd.×14可使經(jīng)BCG啟動內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠血清TNF水平上升。此結(jié)果與作者過去報道靈芝促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬，加速碳粒廓清，提高網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能的結(jié)論一致。上述結(jié)果說明靈芝可以通過間接的方式提高機(jī)體防御機(jī)制，從而發(fā)揮抗腫瘤與抗感染的作用。
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