| 靈芝對超氧陰離子自由基的作用 |
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提要 本文用黃嘌呤——黃嘌呤氧化酶——魯米諾化學(xué)發(fā)光檢查法以及電子順磁共振（ESR）法，測量靈芝清除超氧陰離子自由基（O-2）的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靈芝在魯米諾化學(xué)發(fā)光法檢測中，有劑量依賴性的清除O-2的作用，其抑制發(fā)光強(qiáng)度50%（LC50）的劑量，靈芝制劑A為48.5μg/ml，制劑B為30.4μg/ml。電子順磁共振ESR法的結(jié)果表明，靈芝制劑A和B（0.25μg/ml）分別使ESR信號強(qiáng)度降低84%和86%左右。以上結(jié)果說明靈芝能清除O+2，具有抗氧化劑作用。
關(guān)鍵詞 靈芝；自由基；超氧陰離子自由基；魯米諾化學(xué)發(fā)光體系；電子順磁共振
臨床資料表明，靈芝能防治衰老和心血管疾病，并具有抗癌、抗炎的作用。已經(jīng)了解，在上述疾病的病理過程中，均有自由基的參與。本文旨在闡明靈芝對超氧陰離子自由基（O-2）的作用。在生物學(xué)領(lǐng)域中，電子順磁共振（ESR）檢測法和魯米諾化學(xué)發(fā)光法（CL體系）是當(dāng)前常用的研究自由基的方法。為互相驗(yàn)證，本研究同時(shí)應(yīng)用以上兩種方法檢測靈芝對O-2的作用。
材料和方法
試劑
黃嘌呤和魯米諾購自Sigma公司。黃嘌呤氧化酶根據(jù)文獻(xiàn)提取。K，O-2為Alfa公司產(chǎn)品。二甲基亞硯（DMSO）購自南新溶劑廠。
靈芝干浸膏粉由日本和漢生藥研究所提供。粉末加蒸餾水配成0.25g/ml，在80℃水浴中振搖4h，離心30000g，15min取上清，為制劑A。粉末配成0.25g/ml，在80℃水浴中振搖4h,置-30℃ 1h，取出，置37℃中融解。如此反復(fù)凍融三次，離心30000g，15min，取上清，為制劑B。制劑A1 B1即以蒸餾水分別稀釋A或B各20倍。
儀器
SHG—1型魯米諾化學(xué)發(fā)光測量儀。Varian E-112電子順磁共振波譜儀，X波段，調(diào)制頻率100kHz，調(diào)制幅度2×1G， 增益5×104，微波功率200mW，時(shí)間常數(shù)0.25s，液氮溫度77K下測量。
魯米諾化學(xué)發(fā)光體系
在1.2×5cm的試管中，加入50μl魯米諾，100μl靈芝，800μl黃嘌呤液，上機(jī)測本底后，加50μl黃嘌呤氧化酶混勻，啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)，記錄光發(fā)射10s。靈芝的LC50根據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)。
電子順磁共振檢測
在順磁樣品測試管中，加入含K，O-2100mmol/L的DMSO 400μl，再加100μl DMSO（作為對照）或靈芝制劑100μl，總?cè)萘繛?00μl，在液氮溫度77K下測量。
結(jié) 果
一、靈芝對魯米諾發(fā)光體系的作用
圖16-1示發(fā)光反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)變化。結(jié)果表明，加啟動(dòng)劑后10s發(fā)光的反應(yīng)最強(qiáng)，以后逐漸減弱。本實(shí)驗(yàn)在魯米諾發(fā)光體系中，加入5～100μg/ml靈芝制劑，測量10s的發(fā)光強(qiáng)度。結(jié)果表明，靈芝制劑A和制劑B都具有濃度依賴性的清除O-2的能力，其抑制發(fā)光強(qiáng)度50%（LC50）的濃度分別為48.5μg/ml和30.4μg/ml（表16-1，2）。
表16-1 靈芝A制劑對化學(xué)發(fā)光的抑制作用（n=3）
靈芝 發(fā)光強(qiáng)度均值 發(fā)光強(qiáng)度 發(fā)光強(qiáng)度抑制
μg/ml GP10s % %
0 49803 100.0 0
100 11340 22.8 77.2
80 12067 24.2 75.8
50 24669 49.5 50.5
40 28403 57.0 43.0
25 38528 77.4 22.6
表16-2 靈芝B制劑對化學(xué)發(fā)光的抑制作用（n=3）
靈芝 發(fā)光強(qiáng)度均值 發(fā)光強(qiáng)度 發(fā)光強(qiáng)度抑制
μg/ml CP10s % %
0 53114 100.0 0
80 9799 18.4 81.6
40 22093 41.6 58.4
30 27230 51.3 48.7
20 29431 55.4 44.6
10 40092 75.5 24.5
5 44078 83.0 17.0
二、靈芝對電子順磁共振波譜的作用
在液氮溫度下，測定O-2自由基g=2.0094, g=2.0020，靈芝制劑A和B對O-2均有明顯歧化作用。加入制劑A使O-2的g1峰高從24.1cm降至4cm，制劑B使之降為3.4cm，當(dāng)制劑A和B各稀釋20倍（制劑A1和B1）時(shí)對O-2仍有歧化作用，但能力隨之降低，A1使峰高降至20.5cm,B1使峰高降至11.9cm。
討 論
自由基是指帶不配對電子的原子、離子和分子。已知存在于細(xì)胞中的氧多數(shù)是通過細(xì)胞色素氧化酶生成水而消耗的，然而部分分子氧在代謝中能接受單個(gè)電子生成超氧陰離子自由基：
O2+e→O-2
一旦生成O-2，將進(jìn)一步還原成H2O2以及活性很強(qiáng)的羥基自由基OH，造成氧自由基對細(xì)胞的損害。例如，氧自由基可使酶失活，DNA斷裂，蛋白交聯(lián)和脂質(zhì)過氧化。此外，目前還提出自由基是衰老的原因。
動(dòng)、植物機(jī)體本身存在保護(hù)機(jī)制即抗氧化保護(hù)機(jī)制，能限制自由基造成的損害。靈芝是傳統(tǒng)的著名中草藥，對與自由基有關(guān)的某些疾病又有療效。為此研究靈芝浸出液清除超氧陰離子自由基的作用，是很有意義的。
本文應(yīng)用的黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶反應(yīng)是一種常用的超氧化合物發(fā)生系統(tǒng)。用黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶——魯米諾化學(xué)發(fā)光法檢測的結(jié)果表明，靈芝對其具有劑量依賴性的抑制能力。靈芝制劑A和B的抑制發(fā)光強(qiáng)度LC50的濃度分別是48.5μg/ml和30.4μg/ml。由于黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶反應(yīng)亦可為黃嘌呤氧化酶抑制劑所抑制，考慮到這種可能性，故同時(shí)應(yīng)用另一種方法驗(yàn)證靈芝清除O-2的能力。
ESR技術(shù)能直接檢測自由基，為此觀察了靈芝對O-2的ESR波譜的影響。結(jié)果表明，靈芝能減弱ESR信號的強(qiáng)度，其抑制作用呈濃度相關(guān)性。
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